NỘI DUNG
Thử nghiệm METHYL RED để kiểm tra khả năng của vi sinh vật lên men glucose tạo các sản phẩm cuối mang tính acid và vượt qua khả năng ổn định pH của môi trường. Giúp phân biệt E. coli (+) với Klebsiella (-), Enterobacter aerogenes (-) và Enterobacter cloacea (-); phân biệt Yersinia spp. (+) với các bacilli gram (-) khác không thuộc dạng đường ruột (-); giúp xác định Listeria monocytogenes (+).
Là phép thử định tính về khả năng sinh acid do một số vi sinh vật sinh acid nhiều.
Cơ sở sinh hóa
Phép thử Methyl Red (MR) dựa trên việc sử dụng MR làm chất chỉ thị pH. để xác định nồng độ ion hydro hiện diện khi một vi sinh vật lên men glucose.
Nồng độ ion hydro tùy thuộc vào tỉ lệ các loại khí (CO2 và H2). Tỉ lệ này là chỉ số về các đường biến dưỡng glucose bởi các vi sinh vật khác nhau.
Phương thức lên men tùy thuộc vào sự biến động của các men. vốn có ở vi sinh vật tham gia biến dưỡng acid pyruvic.
Theo định nghĩa, mọi thành viên của Enterobacteriaceae đều lên men glucose. Trong canh MR-VP sau 18-24 giờ ủ quá trình lên men này sẽ sinh ra các sản phẩm acid. Vì vậy sơ khởi mọi vi sinh vật đường ruột đều cho phản ứng MR (+) khi được thử.
Tuy nhiên sau một khoảng thời gian ủ lâu hơn theo đúng qui trình phép thử. Các vi sinh vật MR (+) tiếp tục sinh acid làm giảm pH. vượt quá khả năng ổn định pH của hệ dung dịch đệm. Và duy trì tính acid trong môi trường (pH 4,3 hoặc thấp hơn).
Các vi sinh vật MR (-) tiếp tục biến dưỡng những sản phẩm lên men sơ khởi. bằng phản ứng tách carboxyl (decarboxylation) sinh ra acetyl methyl carbinol (acetoin) trung tính.
Sự giảm các sản phẩm acid và tăng các sản phẩm trung tính đẩy pH môi trường tăng về hướng trung tính. (pH tăng đến 6,0 hoặc hơn).
E.coli và các vi sinh vật MR (+) khác sinh rất nhiều acid lactic, sucsinic, acetic và formic. Acid formic bị phân giải thành CO, và H2.
E.coli sinh một tỉ lệ tương đương H2 và CO2 (1:1) từ sự biến dưỡng glucose.
Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
Phản ứng chung của quá trình biến dưỡng glucose ở E. coli
2Glucose + H2O2 → acid lactic + acid acetic+ ethanol + 2CO2+ 2H2
(Acid formic→ H2 +CO2)
Vi sinh vật MR (+) sinh ra các acid bền vững duy trì nồng độ ion hydro ở mức cao. cho tới khi đạt đến một nồng độ nào đấy, sau đó mọi hoạt động dừng lại.
Các vi sinh vật MR (-) cũng sinh acid (acetic, lactic và formic). Nhưng chúng có nồng độ ion hydro thấp hơn do sự chuyển ngược về hướng trung tính. bởi các acid hữu cơ bị phân giải thành carbonates. Rồi thành CO, và do khả năng hình thành các hợp chất ammonium từ protein có trong môi trường.
Ngoài ra ở pH dưới 6,3, acid acetic còn chuyển hóa thành các sản phẩm cuối trung tính là acetoin và 2,3-butanediol. Sự hình thành H2 bị ức chế khi CO2 được tích lũy nhiều.
Các loài Klebsiella-Enterobacter MR (-) như Ecloacea và E. aerogenes sinh nhiều ethanol và ít acid hơn E. coli với tỉ lệ CO2H2, là 2:1.
Lượng hydro ít là do không có men hydrogen lyase.
Phản ứng tổng thể của quá trình biến dưỡng glucose ở nhóm Klebsiella- Enterobacter là
Glucose + 1/2 O2 → 2,3-butanediol + H2O + CO2
(2,3-butanediol ↔ acetoin)
Sự chính xác của phép thử MR phụ thuộc vào khoảng thời gian ủ. cần thiết đủ để thể hiện sự khác biệt trong biến dưỡng glucose. Thời gian ủ tối thiểu phải đủ để vi sinh vật MR (+). giảm hết mức và vi sinh vật MR (-) tăng hết mức pH của môi trường.
Phương pháp thử
Môi trường
- Môi trường Clark-Lubs (canh MR-VP, g/1)
- Polypeptone 7
- dextrose (glucose) 5
- K2,HPO4 5;
- nước cất 1000ml,
- pH 6,9.
Hòa tan và rót vào ống nghiệm 16 × 125 mm (5ml/ống).
Hấp ở 121°C 15 phút. Bảo quản ở 4-10°C.
Cấy loãng (cấy lượng nhỏ vi sinh vật) từ khuẩn lạc thuần trên KIA vào ống canh MRVP.
Ủ ở 37°C không dưới 48 giờ, tốt nhất từ 3 – 5 ngày.
Nhỏ dung dịch Methyl Red vào canh đã ủ và đọc kết quả ngay.
Môi trường Clark-Lubs dùng nồng độ pepton và glucose 1%. Cũng có thể dùng nồng độ thấp hơn, tối thiểu là 0,5%. Đủ để vi sinh vật MR (-) không thể đạt được đến nồng độ ion hydro tối đa. Nồng độ 0,5% pepton làm màu môi trường nhạt hơn, cho phép đọc kết quả phản ứng dễ hơn.
Thuốc thử
Chất chỉ thị pH – Methyl Red.
- Hòa tan 0,1g MR trong 300ml cồn 95%.
- Thêm 200ml nước cất.
- Dùng E. coli MR (+) và Klebsiella MR (-) để thử dung dịch MR.
- Bảo quản ở 4°C khi không sử dụng.
Cơ chế hoạt động của thuốc thử
Methyl red có vùng chuyển màu pH từ 4,4 đến 6,0, cho màu đỏ ở pH dưới 4,4.
Màu cam ở pH 5,0 đến 5,8, màu vàng ở pH trên 6,0. Màu vàng vẫn chỉ thị tính acid. Nhưng
nồng độ ion hydro đã thấp hơn nhiều.
Đọc kết quả
- Dương tính – sau khi nhỏ thuốc thử dịch cấy có màu đỏ.
- Âm tính – dịch cấy có màu vàng.
Phản ứng chậm – dịch cấy có màu cam. Ủ tiếp 4 ngày ống chưa thử và làm lại phép thử.
Phương pháp thử nhanh (minitest)
- Cấy tâm của một khuẩn lạc đơn vào 0,5ml môi trường MRVP trong ống nghiệm 13×100 mm. Ủ ở 37°C/18 – 24 giờ.
- Nhỏ một giọt thuốc thử vào ống. Dương tính – màu đỏ sáng, âm tính – màu vàng.
- Có nghiên cứu cho thấy dùng khối lượng nhỏ canh cấy khiến vi sinh vật. được thử tiếp xúc với ôxy không khí tốt hơn. Các vi sinh vật MR (-) phục hồi lại pH ban đầu trong khoảng thời gian ngắn hơn. Phản ứng cho kết quả nhanh hơn.
Lưu ý
- Pepton có trong môi trường có thể ảnh hưởng lên kết quả phép thử. Cần kiểm tra mỗi lộ môi trường trước khi dùng bằng các chủng MR (+) và MR (-).
- Phản ứng MR không thể đẩy nhanh bằng cách tăng nồng độ glucose trong môi trường.
- Không đọc kết quả dưới 48 giờ ủ. Nếu đọc sớm kết quả thường bị dương tính giả do vi sinh vật MR (-). không có đủ thời gian để biến dưỡng hoàn toàn các sản phẩm acid tích tụ do lên men glucose.
- Khi đọc sớm mọi kết quả đều là dương tính.
- Nếu không có môi trường đông khô có thể dùng các môi trường chứa dưới 0,5% glucose. Và pepton có chất đệm phosphate đã được kiểm chứng.
- Tránh đọc kết quả ở canh trùng quá đục bởi sự sinh trưởng của vi sinh vật bị ức chế khi nồng độ vi sinh vật sống vượt quá 9. 10^9/ mL.
- Nói chung khi nồng độ dịch nuôi cấy giảm. Thời gian cần để vi sinh vật MR (+) tích đủ sản phẩm acid nhằm khắc phục hệ thống dung dịch đệm lại tăng.
Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
Xem thêm
Thử nghiệm khả năng đông huyết tương
Nguồn: Biochemical tests for indentification of medical bacterial (Jean F.Mactaddin)
