Thử nghiệm Khả Năng Sinh H2S

Thử nghiệm Khả Năng Sinh H₂S giúp phân biệt một số loài họ Enterobacteriaceae và giống Proteus.

Nguyên tắc

Xác định khả năng của vi sinh vật sinh H₂S từ các axit amin chứa lưu huỳnh. Chất này tạo chất kết tủa màu đen.

Cơ sở sinh hóa

Quá trình phân giải protein tạo ra những axit amin tự do. Một số loài vi sinh vật dị dưỡng có khả năng dùng men giải phóng lưu huỳnh từ. các axit amin chứa lưu huỳnh khác nhau sinh ra khí H₂S. Pepton và cystein, cystine và thiosunfat tất cả đều là những nguồn sinh lưu huỳnh. Nhưng những loài vi sinh vật khác nhau dùng những hợp chất. hoặc những axit amin chứa lưu huỳnh khác nhau để tạo ra H2S. Men chịu trách nhiệm nhiều hoạt tính trên được gọi là Cystein Desulhydrase.

Các acid amin chứa lưu huỳnh là methionine, cystine và cysteine.

Một số vi sinh vật sinh H₂S khi được Nuôi cấy trong môi trường hữu cơ như Pepton phân sẽ khử lưu huỳnh bằng H2 tạo ra khí H₂S.

Quá trình chuyển hóa kỵ khí cysteine sinh ra H₂S acid pyruvic và amonia.

Trên thị trường có rất nhiều môi trường Pepton có chứa sắt để phát hiện việc sinh ra H₂S của Enterobacteriaceae. Chất chỉ thị sulfit có thể khác nhau.

Trong môi trường KIA.  Chất chỉ thị H₂S là C₆H₅FeNO₇ và Na₂S₂O_{3 .}

Cần phải có mặt cả hai chỉ thị trên bởi kết quả cuối cùng là một quá trình gồm hai bước

Bước 1

Vi sinh vật phản ứng với Na₂S₂O₃ qua một phản ứng khử tạo ra sunfat và sunfite. Cần phải có điều kiện axit trong phần đáy của môi trường KIA để phản ứng khử Thiosunfat. Hai loại đường có mặt nhằm tạo ra điều kiện axit đó.

Đây là một quá trình hô hấp kị khí. Theo đó lưu huỳnh đóng vai trò lãnh điện tử để oxi hóa các chất hữu cơ. Thiosunfat sẽ thay sulfate khác như một chất nhận điện tử và nguồn lưu huỳnh của vi sinh vật.

Thiosulfate —- thiosulfate reductase—-sulfite + H₂S

H₂S là chất khí không màu, vì vậy cần có chất chỉ thị thứ 2 để thấy sự hình thành H₂S.

Bước 2

H₂S không màu phản ứng với kim loại nặng là sắt trong ferit amoni citrate. tạo ra một chất kết tủa màu đen không tan là FeS. Amoni citrat sắt III được khuyến cáo sử dụng hơn là sắt II vì hòa tan tốt hơn. Có thể dùng Sulfate Fe II thay cho Fe III.

Sự hình thành H₂S được phát hiện khối khí này tiếp tục tiếp xúc với số kim loại như Pb., Fe đi mới tạo ra các dạng xung kích của các kim loại đó.

H₂S + Fe³⁺ — FeS

Như vậy H₂S có thể hình thành thông qua việc khử một nguồn S dạng vô cơ như thiosulfat. hoặc hữu cơ từ nhóm hoạt động R-SH của axit amin cystein có trong pepton.

PbAc Hay Pb(C₂H₃O₂)2 là chất chỉ thị hình thành của H₂S.

Khi tiếp xúc với PbAc, khí H₂S không màu sẽ tạo ra sulfite chì kết tủa đen.

PbAc là chất chỉ thị cực nhạy cho phép phát hiện lượng nhỏ H₂S tạo thành.

Nồng độ thấp nhất cần có là 0,2Mm để phát hiện sulfite trong pepton.

PbAc  + H₂S — PbS + H₂O + Ac

Khả năng sinh H2S là một đặc tính bền vững. Những vi khuẩn sinh H₂S thường cũng tạo khí trong môi trường có cặp Carbohydro.

Khi xác định khả năng sinh H₂S cần chú ý đến các yếu tố sau

1. Dạng và sự sẵn tiện của một lưu huỳnh
2. Mức nhạy của phép thử trong việc phát hiện H2S
3. Sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường cơ bản
4. Sự có mặt của men H₂S ở vi sinh vật được thử

Có rất nhiều cách phát hiện khả năng sinh H₂S. Phương pháp axetate chì là nhạy nhất để nhận ra một lượng nhỏ H₂S ở vi khuẩn.

Phương pháp thử

Có thể dùng một trong các môi trường sau

KIA, TSI, SIM, PIA, BSA

Tất cả môi trường trên đều hấp ở 121^oC/15 phút.

Với KIA, TSI cấy trên ống thạch nghiên, phần đáy sâu

Với SIM, PIA cấy đâm xuyên vào tâm ống thạch đứng

Với môi trường BSA cấy trên đĩa

Ngoài ra có thể dùng giấy tẩm acetate chì 5% gắn trên canh trùng để thử khả năng sinh H₂S.

Môi trường đã cấy được ủ 37^oC/24-48h hoặc kéo dài 7 ngày

Có tài liệu cho thấy mức sinh H₂S cao hơn khi ủ ở 30^oC.

Cần cấy đậm vì lượng H₂S tạo ra tỉ lệ với nồng độ vi khuẩn.

Đọc kết quả

Dương tính: khuẩn lạc đen trên môi trường BSA.

Âm tính: không có sự đổi màu

Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com

xem thêm

Thử nghiệm catalase

Thử nghiệm citrate

Thử nghiệm khả năng đông huyết tương

Thử nghiệm Indol

Nguồn: Biochemical tests for indentification of medical bacterial (Jean F.Mactaddin)