NỘI DUNG
Thử nghiệm Indol xác định khả năng sinh indol từ tryptophan. Thường được dùng để phân biệt E. coli (thường+) với Klebsiella (-) Enterobacter (thường -); Proteus mirabilis (-) với các Proteae khác (+); Bacillus alvei (+) với Bacillus spp. (thường -); Haemophilus haemoglobinophilus (+) và Haemophilus influenzae (+) với các Haemophilus spp. khác (thường -); Pasteurella multocida (+) và P. pneumotropica (+) với P. haemolytica (-) và P.urea.
Cơ sở sinh hóa của thử nghiệm Indol
Tryptophan là một acid amin có thể bị ôxy hóa bởi một số vi sinh vật tạo nên 3 sản phẩm biến dưỡng chính có gốc indol là: indol, skatol (methyl indol) và indolacetic acid (IAA), indolacetate.
Một số men nội bào khác nhau tham gia các quá trình này được gọi chung là “tryptophanase”. Chỉ hệ thống men xúc tác cho việc sinh indol nhờ hoạt tính thủy phân đối với cơ chất tryptophan.
Sản phẩm trung gian chính khi phân giải tryptophan là IPA (indolpyruvic acid). Từ IPA sẽ tạo nên indol qua phản ứng tách amin (deamination) hoặc skatol qua phản ứng tách CO, (decarboxylation).
Trong điều kiện in vitro tryptophan bị phân giải theo các phản ứng sau
Tryptophan → IPA
IPA → (deamination) → Indol
IPA → (decarboxylation)→ Skatol
Men tryptophanase xúc tác cho phản ứng deamination. Chỉ tác động lên phần nhánh của phân tử tryptophan và để nguyên nhân thơm trong dạng indol
Tryptophan (tryptophanase, H2O, deamination) → Indol + Acid pyruvic + Ammonia
Phản ứng tách amin và thủy phân xảy ra khi có phân tử nước, men tryptophanase và coenzyme pyridoxal phosphate. Phần amin của acid amin tách ra tạo nên một phân tử ammonia.
Phản ứng tách amin của acid amin gồm 2 dạng: ôxy hóa và khử. Tryptophan bị tách amin theo dạng khử. Amin được giải phóng ra dưới dạng NH, cùng indol, acid pyruvic, năng lượng để vi sinh vật sử dụng.
Acid pyruvic có thể bị phân giải tiếp đến CO2, H2O cùng nhiều năng lượng. NH2 có thể được dùng để tổng hợp một acid amin mới.
Phương pháp thử nghiệm indol
- Môi trường: Nước pepton (tryptone water) – 15g trypton trong 1 lít nước cất, pH 7,3 ± 0,2
- 4 ml/1 ống nghiệm. Hấp 121°C 15 phút.
- Có thể dùng các môi trường kết hợp nhu MIU (Motility Indol Urea), SIM (Sulfide Indol Motility). Khi cần kiểm tra cùng lúc một số đặc tính sinh hóa cần thiết trong việc định danh.
- Nếu không có môi trường đông khô có thể dùng các loại pepton giàu tryptophan (hàm lượng khoảng 1%) để pha.
Thuốc thử
Thuốc thu Erlich
- p-Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) 2,0 g.
- ethyl alcohol (100%) 190 ml.
- HCl đậm đặc 40 ml.
Thuốc thử Kovacs
- amyl hoặc isoamyl hoặc butyl alcohol 150 ml
- p-Dimethylamino benzaldehyde 10 g.
- HCI dam dặc 50 ml.
- Thuốc thử có độ bền cao khi dùng isoamyl alcohol.
Để hòa tan aldehyde cần đun nhẹ (50 – 60°C) trên bếp cách thủy.
Thử nghiệm
- Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống nghiệm đã cấy và ủ 24 hoặc 48 giờ.
- Trước khi thử có thể thêm 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm và lắc đều. Đợi cho dung mới rút indol và nổi lên.
- Kiểm tra chất lượng: Bằng E. coli (indol +) và Klebsiella (indol -),
Bảo quản
Thuốc thử khi không dùng, được bảo quản ở 4oC và cần được kiểm tra chất lượng hàng tuần.
Cơ sở hóa học của phản ứng thử
Nhân pyrrol của indol chứa nhóm CH2 kết hợp với nhân benzene của p-DMABA tạo nên một phức chất dạng quinone màu đỏ tía. Đây chính là chất được nhận thấy trong phản ứng dương tính.
Đọc kết quả
Dương tính: Màu đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường.
Âm tính: Bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng của thuốc thử.
Kết quả biến động: Màu cam trên bề mặt môi trường do có skatol, một chất methyl hóa có thể là tiền thân của indol.
Phương pháp thử nhanh
Phương pháp thử nhanh và nhạy nhất đối với indol là dùng p-Dimethylamino cinnamaldehyde (p-DMACA) thay cho p-DMABA (dung dịch 1% trong HCl 1% V/V).
Phương pháp này cho phép phát hiện lượng indol với nồng độ đến 3 ppm. Phản ứng dương tính cho màu xanh lục hoặc xanh dương, phản ứng âm tính – màu trắng hoặc vàng.
Lưu ý
- Khi dùng nước pepton thay cho canh tryptophan cần phải kiểm tra bản thân môi trường bằng một chủng indol (+). Điều này cần thiết để thử xem lượng tryptophan có đủ để tạo indol không. Đồng thời xác định khoảng thời gian ủ tối ưu. Có những lô hàng và những chủng loại pepton khác nhau được bán trên thị trường. Nhưng một số không thích hợp cho quá trình tạo indol do chứa hàm lượng tryptophan thấp,
- Tuyệt đối không dùng môi trường pepton có chứa glucose (như môi trường MRVP) để thử indol. Sự hình thành indol chỉ xảy ra ở những vi sinh vật có khả năng lên men đường hoặc rượu.
- Những vi sinh vật sử dụng đường, rượu nhờ quá trình oxy hóa không có khả năng sinh indol. Mức acid cao do lên men glucose có thể ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật. hoặc ức chế hoạt động của men tryptophanase. Bổ sung tryptophan có tác dụng kích thích quá trình tạo indol trong khi glucose có tác dụng ức chế.
- Một số vi sinh vật tạo indol và phân hủy nó cũng nhanh với tốc độ tương đương. Vì vậy có thể sinh phản ứng âm tính giả (chủ yếu ở Clostridium spp.).
- Môi trường kiềm nhẹ (pH 7,4 – 7,8) là tối ưu cho quá trình tạo indol. Việc giảm pH (acid hóa) làm giảm sự tạo indol sinh phản ứng âm tính giả hoặc dương tính yếu.
- Môi trường nuôi cấy thử indol cần được ủ trong điều kiện hiếu khí. Giảm áp lực ôxy cũng làm giảm khả năng tạo indol.
- Thuốc thử Kovacs cần được pha mới khi dùng, song cũng có thể bảo quản vài ngày ở 4-10°C. Nếu để dài ngày ở nhiệt độ phòng thuốc sẽ đổi màu (vàng sang nâu) và kém nhạy hơn. Nên dùng chai nâu nắp thủy tinh để chứa thuốc thử.
- Cần dùng dòng thuần (một khuẩn lạc rời) khi thử để tránh nhiễu kết quả.
- Các thuốc thử Kovacs và Erlich không phải chỉ đặc hiệu cho indol. Indolacetic acid (a-methylindol) cũng được tạo thành từ indol, cũng tác dụng với các thuốc thử trên sinh màu đỏ.
- Trong thực tế các thuốc thử trên có thể tác dụng với 17 hợp chất dạng indol khác nhau sinh màu đỏ. Nhưng nếu dùng một dung môi (như ether, xylene hoặc chloroform) để kéo indol trước khi nhỏ thuốc thử. Màu đỏ trong lớp dung môi trên bề mặt chỉ hình thành do tác dụng của indol và skatol
Indol + Skatol + thuốc thử – Hợp chất màu đỏ
Thủ thuật trên còn có một ưu điểm nữa là tránh được nguy cơ phản ứng dương tính giả do bản thân tryptophan cũng có khả năng cho phản ứng màu với p-DMABA.
Một số chủng Proteus vulgaris, Providancia, Aeromonas cho phản ứng dương tính giả khi dùng phương pháp thử nhanh.
Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
Xem thêm
Thử nghiệm khả năng đông huyết tương
Nguồn: Biochemical tests for indentification of medical bacterial (Jean F.Mactaddin)
