NỘI DUNG
Thử nghiệm catalase nhằm xác định sự có mặt của men catalase. Phản ứng thường được dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí với vi sinh vật kỵ khí, Bacillus (+) với Clostridium (-), Streptococcus (-) với Micrococcus hay Staphylococcus (+), Listeria monocytogenes (+) với Erysipelothrix (-).
Cơ sở sinh hóa của thử nghiệm catalase
Do ôxy có thể tạo ra hàng loạt những dẫn xuất mang độc tính đối với vi sinh vật. Vi sinh tự “giải độc” bằng cách tạo ra men có khả năng phá hủy sản phẩm chứa ôxy. Điển hình của loại men này là catalase. Men catalase có ở vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy nghi chứa cytochrome, ngoại trừ Streptococcus spp.
Thông thường một vi sinh vật không có hệ cytochrome thì cũng không có men catalase. Nên không thể phân cắt H2O2 (hydrogen peroxide). Đa số vi sinh vật kỵ khí (như Clostridium chẳng hạn) có men peroxidase thay vì catalase.
Tuy nhiên trắc nghiệm catalase không phải là đặc hiệu và có thể bị nhiễu bởi các men peroxidase.
Cả catalases và peroxidases đều được gọi dưới một tên phân loại chung là “hydroperoxidases”. Peroxidase là men thực vật song cũng có trong sữa và bạch cầu; catalase có ở thực vật và động vật.
Catalase là một hemeprotein, coenzyme của nó là haemin (iron protoporphyrin) chứa 4 nguyên tử sắt III. Kkhả năng chuyển hóa thuận nghịch giữa hai trạng thái ôxy hóa và khử trong thời gian hoạt động.
Bằng chứng cho thấy một vài vi sinh có thể có men catalase không chứa sắt. Và hoạt tính catalase có thể yếu hoặc mạnh ở các Lactobacilus khác nhau.
Hydrogen peroxide được hình thành như một sản phẩm cuối dạng ôxy hóa của sự phân giải đường kiểu hiếu khí. Flavoprotein (loại enzyme màu vàng do có chứa coenzyme riboflavin tức vitamin B,). dạng khử phản ứng trực tiếp với khí ôxy bằng cách khử điện tử. tạo H2O2 chứ không phải do tác động trực tiếp giữa hydrogen và ôxy phân tử.
Phương trình phản ứng
FPH2+ O2 → FP+ H2O2
Flavoprotein dạng khử Flavoprotein dạng ôxy hóa
H2O2 khi tích tụ sẽ gây độc và làm chết vi sinh vật. Catalase có tác dụng phân giải H2O2. Ôxy hóa các cơ chất thứ cấp khác, song không phân giải được các peroxide khác.
Đã nhiều năm nay người ta cho rằng catalase đóng vai trò chủ chốt trong tế bào như một cơ chế để phân hủy H2O2. Hình thành do hoạt động của các men như dehydrogenase dạng hiếu khí. Một số tác giả cho rằng các men peroxidase đóng vai trò vượt trội hơn nhiều so với catalase trong chức năng này.
Sự phân hủy của H2O2, xảy ra nhờ hoạt động của hai loại men sau
(1) Catalase (hydrogen peroxide oxidoreductase) và
(2) Một trong số các men như peroxidase, NAD dạng khử, NADP dạng khử, cytochrome c, glutathione.
Trong phản ứng phân giải, một phân tử H2O2, hoạt động như cơ chất. Phân tử kia hoạt động như chất cho.
Cơ chất bị khử bởi các nguyên tử hydrogen của chất cho tạo nên cơ chất bị khử và chất cho bị ôxy hóa.
H2O2+H-O-O-H—catalase 2 H2O + O2
Catalase còn có thể sử dụng một số cơ chất khác như vài loại alcohol,acid nitrous (HNO,), acid formic (HCOOH). Một số cơ chất khác không đặc hiệu như các amine thơm, phenols, các acid thơm… Catalase hoạt động tối ưu ở pH 7,0.
Hóa chất thử nghiệm catalase
(1) Hydrogen peroxide 30% (Superoxal), giữ lạnh trong chai sẫm màu, tránh ánh sáng.
(2) Dung dịch đệm phosphate (M/15), pH 7,0.
Cần kiểm tra chất lượng H2O2, trước khi sử dụng.
Có thể dùng Staphylococcus aureus – (dương tính mạnh) và Streptococcus spp. (âm tính) để kiểm tra. Vì chúng dễ thu nhận và không gây hại khi lưu giữ trong phòng kiểm nghiệm.
Cũng có thể dùng blood agar làm kiểm chứng dương tính (do có catalase trong hồng cầu). và chocolate agar (với hồng cầu đã bị phân hủy) làm kiểm chứng âm tính bằng cách nhỏ H2O2 lên bề mặt môi trường.
Bọt khí sẽ sủi mạnh trên môi trường thạch máu. Superoxal rất không bền nên cần kiểm tra hàng ngày hoặc ngay trước khi dùng. Các dung dịch thử cần được bảo quản ở 4°C khi không sử dụng.
Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi
Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
Phương pháp thử
Thử trên lam
Dùng kim cấy dích lấy tâm của khuẩn lạc thuần (18- 20 giờ ủ) đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vi sinh vật trên lam. Việc dùng kim hoặc khuyên cấy trộn lẫn H2O2 vào vi sinh vật là không cần thiết.
Thử trong ống nghiệm
Nhỏ 1mL H2O2 30% lên dòng thuần vì sinh vật cấy dày trên mặt thạch nghiêng (không dùng thạch máu). Quan sát các bóng khí xuất hiện tức thì và ghi nhận kết quả.
Phương pháp mao dẫn
Đặt ống mao dẫn đường kính 1mm, dài 67 mm trong cốc 50mL chứa 10mL dung dịch H2O2 3%. Do lực mao dẫn H2O2 sẽ dâng lên khoảng 20 mm.
Chạm đầu ống mao dẫn chứa H2O2 vào tâm khuẩn lạc cần thử trên môi trường thạch thường hoặc cả thạch máu.
Khuẩn lạc có thể thuộc dạng thuần hoặc khuẩn lạc tách rời trên đĩa cấy hỗn hợp. Theo dõi không khí trào lên theo ống mao dẫn.
Trường hợp dương tính mạnh O, có thể đẩy H2O2 trào khỏi đầu ống.
Phương pháp lamelle
Dùng kim cấy lấy tâm khuẩn lạc đặt lên lam kính, nhỏ một giọt HạO, 0,5% lên và đậy lại bằng lamelle. Theo dõi bóng khí bị giữ lại dưới lamelle.
Ngoài ra còn có những phương pháp khác dựa trên phản ứng sinh màu giữa amine thơm hoặc phenol và H2O2 do catalase và peroxidase xúc tác.
Đọc kết quả phép thử catalase
Dương tính (tạo O2). Các bóng khí xuất hiện tức thì (hoặc trong vòng 10 giây theo phương pháp 3);
Âm tính (không tạo O,): không có bóng khí.
Lưu ý
- Độ nhạy của phản ứng thử có thể thay đổi tùy theo chủng loại vi sinh vật và nồng độ H2O2 được sử dụng.
- Khi thực hiện trắc nghiệm trên lam không được đảo lộn trình tự tiến hành (không đưa H2O2 lên làm trước vi sinh vật). Vì sắt lẫn platinum có trong kim cấy có thể gây phản ứng dương tính giả.
- Kim cấy bằng nichrome không gây phản ứng dương tính giả.
- Nên dùng thể nuôi cấy đã ủ 18-24 giờ. Những khuẩn lạc già hơn có thể mất hoạt tính catalase và gây phản ứng âm tính giả.
- H2O2 30% là một chất ăn da rất mạnh, nếu bị nhỏ lên da cần rửa ngay bằng cồn 70% (không dùng nước) để trung hòa.
- H2O2 rất không bền và dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng. Dung dịch luôn cần được giữ lạnh mỗi khi không dùng và nên kiểm tra hoạt tính ngay trước khi sử dụng.
- Có ý kiến cho rằng hoạt tính của catalase ở Lactobacilli tăng lên khi chúng được nuôi cấy trong môi trường có glucose ở nồng độ thấp.
- Không có những tiêu chuẩn vạn năng cho nồng độ H2O2. Dùng thử catalase cũng như sự phân hạng về cường độ và tốc độ hoạt động của catalase.
- Cần chuẩn hóa nồng độ và cách ghi nhận kết quả trong phòng.
- Cần biết rằng đôi khi có thể phân lập được những dòng catalase (-) từ những loài được coi là catalase (+) như E. coli, S. aureus. Điều này tuy hiếm nhưng không phải là dị thường.
Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi
Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
Đọc thêm: Thiết kế phòng vi sinh
Nguồn: Biochemical tests for indentification of medical bacterial (Jean F.Mactaddin).
