NỘI DUNG
Trước khi hiểu nguyên tắc real time PCR ta cần hiểu PCR là gì
PCR (Polemerase Chain Reaction) là gì
Là phản ứng khuếch đại gen (tạo nhiều bản sao) hay phản ứng chuỗi trùng hợp. Là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm khuếch đại một đoạn DNA mà không dùng sinh vật sống. PCR dùng nghiên cứu sinh học, y học phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán nhiễm trùng, tách dòng gen, và xác định huyết thống.
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh. Ông đoạt giải Nobel về Hóa học năm 1993 chỉ sau 7 năm khi đưa ra ý tưởng. Đó là cách DNA nhân lên nhiều lần qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase.
DNA polymerase có trong sinh vật sống để thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung. Theo quy trình PCR gốc Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96 °C. Khi DNA polymerase bị phá hủy phải bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian. Nó cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR.
Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt). DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao). Vì thế khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp nung nóng để tách sợi DNA. Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn.
Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA.
Dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu được phân lập từ Archaea. Có cơ chế sửa sai, làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Sự kết hợp giữa Taq và Pfu cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.
Nguyên tắc Real time PCR là gì
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay
sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Chính vì vậy nên được gọi là real-time.
Real-time PCR khác PCR là không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả. Điều này để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không. Vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng.
Có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt. Và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được.
[pdf-embedder url=”https://www.triphuc.com/wp-content/uploads/2020/04/realtimePCR_basic-đã-mở-khóa.pdf” title=”realtimePCR_basic-đã mở khóa”]
Xem thêm thiết kế phòng thí nghiệm vi sinh
Trí Phúc
