NỘI DUNG
Thử nghiệm VP tìm acetoin để phân biệt E.coli với các nhóm Klebsiella-Enterobacter. Giúp xác định Listeria monocytogenes.
Nguyên tắc thử nghiệm VP (Voges- Proskauer)
Xác định khả năng của một số vi sinh vật tạo sản phẩm cuối mang tính trung tính là acetoin. (Acetylmethylcarbinol – AMC) do lên men glucose.
Cơ sở sinh hóa thử nghiệm VP
Dựa trên sự phát triển của acetoin, sản phẩm cuối trung tính hình thành do biến dưỡng glucose.
Glucose chuyển hóa thành acid pyruvic. (là chất trung gian chủ yếu trong quá trình biến dưỡng glucose).
Từ pyruvic acid vi sinh vật có thể theo nhiều con đường biến đổi sinh hóa khác nhau. Sự tạo acetoin là một trong những con đường biến đổi sinh hóa khác nhau.
Sự tạo acetoin là một trong những con đường biến dưỡng glucose xảy ra ở vi sinh vật.
Thử nghiệm VP tìm acetoin để phân biệt E.coli với các nhóm Klebsiella-Enterobacter. Mặc dù các vi sinh vật thuộc nhóm Enterobacteriacae cũng có thể gây phản ứng VP (+). Đặc tính phân loại của Enterobacteriaceae là dạng lên men sinh acid hỗn hợp hoặc acid formic. Cho thấy các sản phẩm cuối do lên men glucose của chúng là các acid: fomic, acetic, succinic, ethanol, H2 và CO2.
Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
Các vi sinh vật lên men acid hổn hợp này có thể chia làm hai nhóm
- Sinh acid nhưng không sinh 2,3-butanediol như E.Coli
- Sinh 2,3-butanediol là sản phẩm cuối chủ yếu của như nhóm Kebsiella-Enterobacter.
Sản phẩm cuối chủ yếu từ việc sử dụng pyruvate ở các nhóm Kebsiella-Enterobacter., Seratia, Bacillus và nhiều vi sinh vật khác là 2,3-butanediol.
Tuy nhiên, thử nghiệm VP lại dựa trên việc phát hiện acetoin, chất tiền thân tạo 2,3-butanediol.
Phân tử acetoin hình thành khi tách CO2 từ hai phân tử acid pyruvic. Acetoin và 2,3-butanediol chuyển hóa qua lại nhờ hệ thống oxy hóa thuận nghịch.
Dưới tác động của oxy không khí và kiềm, 2,3-butanediol bị oxy hóa thành acetoin do men 2,3-butanediol dehydro genase.
Acetoin có thể bị oxy hóa thành diacetyl. Acetoin bị khử thành 2,3-butanediol do tác dụng của men diacetyl reductase.
Khi có oxy không khí và pH kiềm, sản phẩm cuối là acetoin và 2,3-butanediol bị oxy hóa thành diacetyl gây phản ứng tạo màu trong thử nghiệm VP. Nói cách khác diacetyl là sản phẩm oxy hóa của acetoin.
Yếu tố pH trong môi trường VP là cực kỳ quan trọng.
pH trên 6,3 các acide acetic và formic được tích lũy. CO2, H2, acetoin và 2,3-butanediol hình thành một cách hạ chế.
pH dưới 6,3 acid acetic chuyển hóa thành acetoin và 2,3-butanediol. Việc sinh H2 giảm và CO2 tăng.
Phản ứng tổng thể của quá trình biến dưỡng glucose ở các nhóm Klebsiella – Enterobacter là
Glucose—-2,3-butanediol + 2CO2 + H2.
Phương pháp thử
Môi trường: Clark-Lubs (canh MR-VP), pH =6.9. Cho 5 mL vào ống nghiệm. Hấp 121oC/15 phút.
Lấy khuẩn lạc từ môi trường KIA hoặc TSI đã ủ 18-24h.
ủ 37oC/24-48h
Một số vi sinh vật như Enterobacter hafniae có phản ứng VP biến động ở 37oC nhưng dương tính ở 25-30oC. Vì vậy nếu nghi ngờ cần ủ song song 25oC.
Nhỏ các thuốc thử VP trực tiếp vào dịch nuôi cấy trước khi đọc kết quả.
Thuốc thử có 3 công thức khác nhau
1.Phương phap Barrit.
- Dung dịch A: 5% a-naphtol trong cồn tuyệt đối.
- Dung dich B: 40% KOH.
2.Phương pháp Koblentz
- Dung dịch A: 5% a naphtol trong cồng 95%
- Dung dịch B: 0.3% cretine trong dung dịch KOH 40%.
- Phương pháp O’Meara: dung dịch đơn 0,3% creatine trong KOH 40%
Nhỏ các dung dịch theo đúng trình tự sau
Phương pháp 1,2:
Nhỏ 6 giọt dung dịch A, rồi 2 giọt dd B.
Phương pháp 3 nhỏ 1mL thuốc thử.
Lắc nhẹ ống khoảng 1 phút để đưa oxy vào môi trường để oxy hóa acetoin. Đọc kết quả sau 10-20 phút (phương pháp 1,2), chậm nhất là 4 giờ (phương pháp 3).
Lưu ý
Đôi khi một chủng sinh acetoin không cho phản ứng VP dương tính. Để khắc phục trường hợp này cần đun nhẹ dịch nuôi chưa thuốc thử VP. Vi khuẩn VP (+) sẽ tạo màu đỏ trong khi vi khuẩn không sinh acetoin vẫn giữ nguyên.
Môi trường thử MR-VPcó màu sắc giống như môi trường indol. Vì vậy cần ghi nhãn trước khi cấy. Để tránh nhầm lẫn
Các vi sinh vật trong họ Enterobacteriaeae đều sinh acetoin từ glucose nhưng không phải các chủng đều lên men acetoin. Một số vi khuẩn biến dưỡng acetoin bằng hóa trình khử hoặc oxy hóa. Làm giảm lượng cơ chất cần phát hiện theo thử nghiệm VP. Acetoin có thể chuyển hóa thành 2,3-butanediol cho phản ứng dương tính giả. Quá trình biến dưỡng trung gian thường biến động theo các chủng.
Không nên chỉ dựa vào 2 thử nghiệm MR và VP để phân biệt E.coli và nhóm Klebsiella -Enterobacteria. Cần kết hợp với thử nghiệm indol và citrate. Không loại trừ khả năng acetoin bị phân hủy khiến 2 thử nghiệm trên không giá trị định danh.
Phần lớn những vi khuẩn có phản ứng VP (+) đương nhiên có tính chất MR(-) và ngược lại. Do sự hình thành acetoin. Nhưng một số vi khuẩn như Proteus mirabilis hoặc Hefnia alvei có thể cho MR và VP dương tính.
Trình tự nhỏ các dung dịch thuốc thử Baritt rất quan trọng.
Việc đảo ngược trình tự có thể gây dương tính yếu hoặc âm tính giả.
Lượng KOH cần nhỏ chính xác và không vượt 0,2 mL. Lượng dư KOH có thể che lấp phả nứng dương tính yếu do tạo màu đồng từ phản ứng của riêng a-naphtol.
Cường độ màu tối đa từ lượng acetoin tối thiểu trong ống VP dương tính đạt đến sau khi để yên 1 giờ. Quá thời gian trên chủng VP(-) có thể sinh màu đồng gây nhầm lẫn khi đọc kết quả. Hiện tường trên thường thấy ở chế độ ủ 30oC hơn là 37oC.
Tuyệt đối khhoong dùng môi trường chứa nước thịt hoặc cao thịt để nuôi vi sinh vật trong thử nghiệm này. Vì sự có mặt acetoin diacetyl và các dẫn xuất có sẵn trong dịch chiết sẽ cho dương tính giả.
Cần tư vấn, đào tạo, thiết kế phòng vi sinh, xây dựng ISO 17025, ISO 15189 mời gọi Tel 0919 099 777. Email: tuvandaotaotriphuc@gmail.com
xem thêm
Thử nghiệm khả năng đông huyết tương
Nguồn: Biochemical tests for indentification of medical bacterial (Jean F.Mactaddin)
